علم غذا مرجع صنایع غذایی و تغذیه مرجع صنایع غذایی و تغذیه
جنس استافيلوكوکوس‌ها متعلق به خانواده ميكروكوكاسه و شامل 23 گونه شناخته شده ميباشد كه 12 گونه آن بخشي از فلور طبيعي ميكروبي انسان است.
سه گونه مهم از نظر کلینیکی: استافيلوكوكوس آرئوس، استافيلوكوكوس ساپروفيتيكوس.
گونه آرئوس بيماری‌زا بوده و دو گونه ديگر انواع فرصت طلب و يا عامل عفونت‌هاي بيمارستاني ميباشد.
اين ميكروب‌ها گرم مثبت، غير متحرك، كاتالاز مثبت، اكسيداز منفي و به شكل كوكسي (خوشه ای) است. از ارگانيسم‌هاي مزوفيل هستند که دامنه حرارتي رشد c◦7– c◦48 و اپتيمم حرارت رشد c◦37 است.
در محيط‌هاي هوازي يا هوازي اختياري قادر به رشد مي‌باشند. گونه آرئوس عامل اصلي مسموميت غذايي استافيلوكوكي و عفونت‌هاي خارج روده‌اي مانند زخم، دمل، ذات الريه، مننژيت، باكترامي، سندرم شرك توكسيك و … ميباشد. توليد انتروتوكسين اساساً مربوط به گونه آرئوس است هر چند توليد آن توسط ساير گونه‌ها از قبیل اينترمديوس و هايكوس گزارش گرديده است. به عنوان يك بيماري نسبتاً ملايم با طول عمر كوتاه، مسموميت غذايي استافيلوكوكي به احتمال زياد نسبت به ساير بيماري‌هاي ناشي از مواد غذايي كمتر از حد واقعي گزارش شده است و اغلب موارد گزارش شده بيماري مربوط به مواقع شيوع بيماري ميباشد و تنها تعداد اندكي از حالت پراكنده بيماري شناسايي گرديده است.
التهاب روده‌اي – معده‌اي استافيلوكوكي در اثر خوردن غذا حاوي يك يا چند نوع انتروتوكسين كه توسط تنها چند گونه و نژاد استافيلوكوكوس اورئوس كه كواگولاز و ترمونوكلئاز مثبت هستند توليد مي‌شود، ولي بسياري از گونه‌هاي استافيلوكوكوس كه هيچ يك از اين دو را توليد نمي‌كند قادر به توليد انتروتوكسين هستند. تنها 6 گونه از استافيلوكوكوس، كوآگولاز مثبت هستند كه معمولاً نوكئاز مقاوم به گرما نيز توليد مي‌كند. 10 تا از گونه‌هاي كوآگولاز منفي انتروتوكسين توليد مي‌كنند ولي نوكلئاز توليد نمي‌كنند يا در صورت توليد نوكلئاز از نوع حساس به گرما توليد مي‌شود. نژادهاي انتروتوكسي ژنتيك كوآگولاز منفي در توليد هموليزين يا تخمير مانيتول يكسان عمل نمي‌كند. استافيلوكوكوس اينترمديوس از جمله گونه‌هاي كوآگولاز مثبت است كه انتروتوكسين نيز توليد مي‌كند اين ارگانيسم در مجاري بيني، پوست، حيوانات، اساسا وجود دارد ولي به ندرت در انسان ديده مي‌شود.
استافيلوكوكوس ارئوس آنزيم‌ها و توكسين‌هاي متعددي توليد مي‌كند كه باعث بقاي اين باكتري، تجزيه پروتئين ها، كربوهيدرات‌ها، چربي‌ها جهت تأمين مواد مورد نياز، مقاومت در مقابل داروها تأمين قدرت بيماري زايي باكتري ميگردد.
مهمترين آنزیم‌ها و توکسین‌ها
1) كواگولاز كه با بيماري‌زایي ميكروب ارتباط نزديكي دارد و جهت تفكيك استافيلوكوكوس ارئوس از ساير استافيلوكوكها مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اين آنزيم باعث انعقاد پلاسما و محافظت مكانيكي باكتري در موضع‌هاي عفوني ميگردد.
2) هموليزين كه باعث آزاد شدن هموگلوبين گلبول‌هاي قرمز خون مي‌شود، توسط سويه‌هاي استافيلوكوكوس ارئوس حداقل در سه نوع توليد مي‌شود ( هموليزين‌هاي β ,α و دلتا ). اغلب سويه‌هاي انساني توليد هموليزين آلفا مي‌نمايد كه يك سم كشنده است. هموليزين β بسيار كمتر از هموليزين α سمي است و سويه‌هاي حاوي اين نوع هموليزين بارها از حيوانات اجرا گرديده است.
3) هموليزين دلتا توسط اكثريت سويه‌هاي كواگولاز مثبت استافيلوكوكوس آرئوس انساني توليد مي‌شود، در صورتي كه سويه‌هاي كواگولاز منفي فاقد آن هستند.
4) لوكوسيدين كه براي لوكوسيت‌هاي انساني سمي هستند و باعث مرگ آن ها مي شود.
5) پني سيليناز كه باعث باز شدن حلقه بتالاكتام پني سيلين ميگردد و اثر ضد ميكروبي آن را خنثي مي‌سازد.
آنزيم‌هاي مهم ديگر شامل ليپاز، هيالورونيداز، استافيلوكيناز (فيبرينيد ليزين )، دزوكسي ايپرنوكلئاز، فسفاتاز، كاتالاز و پروتئاز مي‌باشند كه بعضي از آنها در بيماري‌زايي باكتري دخالت دارند.
6) آنتروتوكسين‌هاي استافيلوكوكوس آرئوس پروتئين‌هاي سادهاي هستند كه بلع آن توسط انسان يا حيوانات حساس باعث استفراغ و اغلب اسهال در عرض چند ساعت ميگردد.
اين آنتروتوكسين‌ها اگزوتوكسين‌هائي هستند كه توسط سلول‌هاي باكتري به غذا و محيط كشت انتشار پيدا مي‌كنند. استافيلوكوك‌هاي آنتروتوكسين‌زا تقريباً هميشه قادر به توليد كواگولاز مي‌باشند ولي همه استافيلوكوك‌هاي كواگولاز مثبت هميشه آنتروتوكسين‌زا نمي‌باشد. در بعضي موارد تا سويه‌هاي كواگولاز منفي استافيلوكوك نيز توليد آنتروتوكسين مي‌كند. اين آنتروتوكسين‌ها نسبتاً پايدار هستند از جمله به 0.3% فرمالين به مدت 48 ساعت به آنزيم‌هاي پروتئوليتيك مثل تريپسين، رنين و پپسين، مقادير 10 – 3 =PHبه سرمايي يخچالي به مدت 67 روز، به انجماد به مدت چندين ماه و به محلول كلر به غلظت 5.9 قسمت در ميليون به مدت 3 دقیقه مقاوم ميباشد.
همچنين آنتروتوكسين باكتري به حرارت مقاوم است و به تدريج در حرارت جوش از بين مي‌رود ولي مدت min30 مقاومت مي‌كند و لذا پخت معمولي، پاستوريزاسيون و خشك كردن آن را از بين نمي‌برد. بيماري‌ها توليد آنتروتوكسين توسط گونه‌هاي متعددي از جنس استافيلوكوكوس و همچنين ميكروكوكوس لوته اوس گزارش شده اما موارد مسموميت گزارش نشده است. مسموميت حاصل از استافيلوكوكوس آرئوس يكي از شايعترين مسموميت‌هاي غذائي است. برخلاف ساير بيماري‌هاي غذائي دوره كمون كوتاه‌تري دارد (30min- 8h)
علائم مسموميت: تهوع، استفراغ، اوغ زدن، كرامپ شكمي، نبض ضعيف، لرز، ناتواني، تعريق، شوك، تنفس كم عمق، حرارت بدن پائين تر از حد طبيعي ميباشد .
بهبود از اين مسموميت كه به ندرت كشنده است معمولاً بين 24- 48 ساعت ميباشد .
رشد استافيلوكوكوس به تعداد بيش از يك ميليون در گرم، لازم است تا توكسين كافي توليد شده و علام مسموميت بروز نمايد. چندين نوع آنتروتوكسين با آنتي ژن پروتئيني مختلف شناخته شده است كه شامل توكسين‌هاي A,B,C1,C2,C3,D,E و ساير توكسين‌ها ناشناخته است. آنتروتوكسين A سمي‌ترين نوع و شايعترين عامل به وقوع مسموميت‌هاي غذائي استافيلوكوكي است. (مقادير كمتر از یک ميكروگرم آنتروتوكسين A باعث مسموميت مي‌شود).
بيماران مبتلا به التهاب روده باريك و قولون توكسيني به نام سیتوپاتيك توكسين كه از استافيلوكوكوس آرئوس مقاوم به آنتي بيوتيك موجود در روده توليد مي‌شود، به دست آمده است. اين توكسين باعث التهاب شديد قولون شده و در صورت عدم درمان به مرگ منجر مي‌شود . آنتروتوكسين استافيلوكوكي برخلاف آنتروتوكسين‌هاي كلاسيك ( مثل كلراتوكسين ) روي سلول‌هاي اپي تليان عمل نمي‌كند بلكه اثر استفراغ آن روي عصب کاگ و سمپاتيك و از آنجا به طرف مركز استفراغ در مغز صورت مي‌گيرد و بنابراين آنتروتوكسين استافيلوكوكوس آرئوس به طور صحيح‌تر نورو توكسين ناميده مي‌شود براي تشخيص توكسين روش سرولوژيكي بهترين روش است.
يكي از خصوصيات استافيلوكوكوس ارئوس، مقاومت آن به نمك و aw پائين است ( به خوبي در محيط 7 – 5 % نمك طعام رشد دارد و برخي از آنها تا غلظت 20% نمك طعام رشد دارند. تا aw =0.83 رشد نموده و در اين aw زمان تقسيم آن 300 دقیقه ميباشد. حداقل aw ثبت شده جهت توليد آنتروتوكسين 0.86 ميباشد. زيستگاه اصلي استافيلوكوكها پوست، غدد پوستي، غشاء موكوسي حيوانات خونگرم است. معمولاً اين ارگانيسم به عنوان پارازيت بي‌خطر بر روي سطح بدن انسان حضور دارد و در آنجا نقش مفيدي در متابوليزه كردن تركيبات پوست و احتمالاً ممانعت از تشكيل كلني توسط ارگانيسم‌هاي بيماري‌زا بر عهده دارد. اما استافيلوكوكوس آرئوس مي‌تواند در موارد خفيف موجب التهابات پوستي نظير ايجاد جوش و در موارد شديدتر زماني كه پوست دچار صدمه گرديده است و مقاومت ميزبان كاهش يافته به عنوان پاتوژن فرصت طلب عمل نمايد. استافيلوكوكوس كوهني روي پوست انسان و معمولاً در مجاري ادراري و زخم‌هاي عفوني يافت مي‌شود. پوست انسان زيستگاه استافيلوكوكوس اپيدميس و استافيلوكوكوس هموليتيكوس ميباشد كه هموليتيكوس با عفونت‌هاي انساني در ارتباط ميباشد . استافيلوكوكوس هاييكوس روي پوست خوك يافت مي‌شود.
اين باكتري در مسير ورودي سطوح پوست طيور نيز يافت شده است پوست پستانداران پست و سایر پستاندارن، زیستگاه استافیلوکوکوس زایلوس و پوست انسان و سایرپ ستانداران پست زیستگاه استافیلوکوکوس سیمولانس می‌باشد استافيلوكوكوس اورئوس مقاومت زيادي به تركيبات شيميايي مثل تلوميت، كلريد، نئوماسین، پلي‌ميكسين و سديم آزيد دارد. اين تركيبات به عنوان عوامل اختصاصي‌كننده محيط كشت استفاده مي‌شود . اورئوس را مي‌توان با توجه به مقاومت بيشتر آن به اكريفلاوين از ساير گونه‌هاي استافيلوكوكي تشخيص داد.
در سس مايونز خانگي، انتروتوكسينها هنگامي توليد شدند كه PH اوليه 15.5 و PH نهايي رشد بالاتر از 7.4 بود.
ارتباط باكتري با مواد غذایي و روش كنترل
راه‌هاي آلودگي آرئوس به طور طبيعي در بيني، گلو، مو، پوست بيش از 50% افراد سالم يافت مي‌شود. هر نوع غذایي كه نياز به عمل آوري دارد مي‌تواند آلوده گردد. زخم‌هاي عفوني، جوش‌ها، دمل‌هاي كارگران مواد غذائي منبع آلودگي است. عطسه و سرفه افراد مبتلا به عفونت‌هاي تنفسي از راه‌هاي ابتلا است. مواد غذائي كنسروي نيز براي آرئوس يك محيط مناسب و عاري از ارگانيسم رقابت كننده است.
باكتري در پوست بدن حيوانات وجود دارد و مواد غذائي با منشا حيواني را آلوده مي‌سازد.
بهترين حمايت كننده‌هاي غذایي براي رشد باكتري
غذاهاي پروتئيني مثل گوشت و فراورده‌هاي گوشتي، طيور، ماهي، فرآورده‌هاي ماهي، شير و فرآورده‌هاي شير، سس‌هاي كرم دار، سالاد ( مرغ ، سيب زميني و … )، پودينگ (شكلات صبحانه) و شيريني‌هاي خامه دار ميباشد . باكتري در مواد غذائي معمولا به وسيله ميكروب بي‌ضرر رقيب مطلوب شده، به همين علت غذاهاي خام هيچ وقت عامل مسموميت غذائي استافيلوكوكي واقع نمی‌شوند. موادغذايي كه حاوي نمك يا شكر باشد نيز محيط مناسبي را براي رشد باكتري محيا مي‌سازد. زيرا از رشد ميكروب حساس جلوگيري شده و رشد استافيلوكوك را محيا مي‌سازد. آرئوس مي‌تواند نمك 10 تا 20 % و قند ساكارز 50 تا 60 % را تحمل نمايند. ميكروب همچنين مقاوم به نيتريت است و لذا در محلوي‌هاي نمكي و يا گوشت نمك‌دار در صورتي كه شرايط رشد مناسب باشد تكثير می‌نماید.
رشد ممكن در ميزان آب آزاد 0.86 در شرايط هوازي و 0.90 در شرايط بي‌هوازي صورت می‌گيرد. اگرچه استافيلوكوكوس آرئوس تخمير كننده و پروتئوليتيك است ولي معمولا رشد آن مزه بدي در غذا ايجاد نمي‌كند تا ظاهر فاسد پيدا كند. همچنين دليل وجود باكتري يا توكسين آن در مواد غذايي از طريق روش‌هاي حسي قابل تشخيص نخواهد بود.
موارد شيوعي وجود داشته كه با مصرف محصولات شيري نظير شير خشك، شير شكلاتي ايجاد شده است . دليل رشد و توليد انتروتوكسينها در شير خام صورت مي‌گيرد و در طي فرآيند پاستوريزاسيون ارگانيسم از بين مي‌رود ولي انتروتوكسين آن باقي مي‌ماند.
نيازهاي غذايي براي رشد
استافيلوكوكوس‌ها از نظر نياز به بعضي تركيبات آلي نمونه بارزي از ساير باكتري‌هاي گرم مثبت ميباشد. اسيدهاي آمينه به عنوان منبع ازت و از ميان ويتامين‌هاي گروه B، تيامين و نيكوتينيك اسيد مورد نياز اين باكتري‌ها مي‌باشند. اين باكتري‌ها در صورت رشد به طور بي هوازي به اوراسيل نياز دارند .
براي رشد هوازي و توليد انتروتوكسين، منوسديم گلوتامات به عنوان منبع كربن، ازت وانرژي لازم است، همچنين نيازمند 3 اسيد آمينه ( آرژنين، سيتئين، فنيل آلانين ) و 4 ويتامين ( يافتوتنات، ميوتين، نياسين، تیامين ) و نمك‌هاي غير آلي مي2باشد . آرژنين براي توليد انتروتوكسين B ضروري است.
روش‌هاي كنترل
1) براي وقوع مسموميت غذائي استافيلوكوكي غذا بايستي با استافيلوكوكوس آرئوس آنتروكسين زا آلوده شود.
2) غذا بايد توانائي حمايت رشد استافيلوكوكي را داشته باشد.
3) غذا بايد در حرارتي مناسب و به مدت مناسب كه بتواند رشد باكتري را فراهم آورد، قرار گيرد تا بتواند به حدي آنتروتوكسين ايجاد كند كه باعث بروز استفراغ گردد.
4) غذا بايد مصرف گردد در موارد 1 و 2 پيشگيري محدود است . زيرا اكثر مواد غذائي در معرض آلودگي بوده و توانايي رشد باكتري را دارند.
كنترل حرارت مهم ترين وسيله موثر جلوگيري از مسموميت‌هاي غذائي استافيلوكوكي است. در واقع اكثريت وقوع مسموميت‌هاي غذائي استافيلوكوكي زمان سرد كردن غذا به صورت ناقص انجام می‌گيرد. حرارت و پخت كافي و سرد كردن مناسب غذا و استفاده از يخچال بهترين وسيله كنترل اين مسموميت‌ها است.
روش‌هاي جداسازي و تشخيص استافيلوكوك در مواد غذایي
اگرچه محيط‌هاي هيپوتونيك مانند محيط‌هاي مايع گوشت نمك‌دار هنوز به طور وسيعي مورد استفاده ميباشد ولي عدم مزيت آنها در تشكيل بازيابي سلول‌هاي استرس ديده استافيلوكوك و عدم توانايي جلوگيري از رشد باسيلوس ميباشد جايگزين مناسب آبگوشت GC است .
محيط انتخابي، محيط‌هاي با غلظت نمكي بالايي مانند محيط جامد حاوي مانيتول و نمك مورد استفاده قرار گيرد، ولي جایي كه محيط بهتر مانند محيط برد پاركر موجود است اين نوع محيط‌ها توصيه نمي‌شود .
محيط بردپاركر
1) قدرت انتخابي بالایي دارد.
۲) سلول‌هاي استرس ديده استافيلوكوك را نيز به خوبي بازيابي مي‌كند و به خصوص زماني كه تعداد زياد ميكروب رقيب در نمونه موجود باشد مناسب است.
محيط ديگري از نوع برد پاركر كه حاوي زرده تخم مرغ است محيط كرانپ ميباشد كه در اروپا مورد استفاده قرار مي‌گيرد. برخلاف محيط برد پاركر، محيط كرانپ اكثرا استافيلوكوك‌هاي كواگولاز منفي را بازيابي مي‌كند و از اين نظر محيط انتخابي براي كليه استافيلوكوكها است.
در مورد محيط برد پاركر بايد توجه داشت كه فرم پرگنه‌هاي ايجاد شده در اين محيط به ندرت با توصيف منتشر شده مطابقت دارد و تغييرات قابل توجهي در پاسخ اين محيط ايجاد مي‌شود.
پرگنه‌هاي رشد گروه استافيلوكوكوس آرئوس در محيط برد پاركر داراي رنگ سياه شفاف است و ظهور هاله روشن در اطراف اين پرگنه‌ها يك وسيله تشخيص است. در صورت ظهور، پس از 48 ساعت گرمخانه‌گذاري در 37 درجه سانتی‌کراد اتفاق مي‌افتد و حتي گاهي اندازه پرگنه‌های استافيلوكوك در اين محيط يكسان نيست. سلول‌هاي ميكروكوكوس نيز ممكن است پرگنه‌هاي كوچكتر قهوه‌اي در اين محيط توليد كند.
تشخيص استافيلوكوك از ميكروكوكوس، استرپتوكوكوس ملزم توليد كاتالاز توسط استافيلوكوكوس و ميكروكوكوس و تخمير گلوكز توسط استافيلوكوكوس و استرپتوكوكوس است.
جهت تفكيك گونه آرئوس از بقيه گونه‌ها آزمايش كواگولاز وسيله بسيار مناسبي است كه هم در داخل لوله و هم بر روي لام قابل انجام است. پلاسماي انساني جهت اين آزمايش توصيه ميگردد ولي پلاسمای خرگوش با EDTA تهيه شده به صورت تجارتي به طور وسيعي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. نتيجه مثبت انعقاد پلاسما توسط آنزيم كواگولاز در داخل لوله را مي‌توان به دو فرم: مثبت قوي و مثبت ضعيف مورد ارزيابي قرار داد . تكليف نتايج ضعيف را مي‌توان با انجام آزمايش ترمونوكلئاز روشن نمود كه در آن پليت حاوي پرگنه استافيلوكوك پس از گرمخانه گذاري در مدت 2 ساعت در C◦ 65 با آگار حاوي توليوئيدين بلو DNA پرشاينده شده ودر 37 درجه گرمخانه گذاري مي‌شود .
توليد هاله صورتي در آگار دليل بر فعاليت ترمونوكلئاز توسط باكتري ميباشد كه با توليد كواگولاز تطابق خوبي دارد. تعيين تيپ فاژ استافيلوكوكوس آرئوس يك تكنيك جا افتاده است و شامل آزمايش 23 تيپ فاژ ميباشد كه اكثريت سويه‌هاي عامل مسموميت غذائي با گروه III فاژي واكنش نشان مي‌دهد اگرچه بعضي نيز با گروه I فاژي واكنش نشان مي‌دهد.
طریقه‌ی تعيين آنتروتوكسين استافيلوكوكي در غذاي عامل مسموميت
خورانيدن غذا به انسان داوطلب يا حيوانات
تزريق آن به حيوانات به فرم جوشيده شده يا صاف شده كشت باكتري جدا شده از غذا
بازيابي آنتروتوكسين از عصاره غذایي و يا صاف شده كشت باكتري جدا شده از غذا با استفاده از روش هاي سرولوژيكي
مدل حيواني كه براي بازيابي آنتروتوكسين استافيلوكوكي مورد استفاده است
داخل صفاتي
وريدي گربه‌ها
بچه گربه‌ها
ميمون‌هاي جوان از نوع رزوس بهترين روش عمل
در اين روش 6 ميمون را انتخاب كرده و به هر كدام 50 میلی‌لیتر از نمونه آنتروتوكسين با استفاده از كاته‌تر خورانيده و آنها را به مدت 5 ساعت تحت نظر قرار مي‌دهيم . استفراغ به وسيله حداقل 2 ميمون واكنش + تلقي ميگردد. و اين روش‌ها به دليل انجام مشكل، قابليت اطمينان متغير، توان بردن كمتر انجام شده و روش‌هاي سرولوژيكي جايگزين اين روش‌ها گرديده است.
روش‌هاي بازيابي سرولوژيكي آنتروتوكسين استافيلوكوكي
چندين سروش سرولوژيكي مورد استفاده است كه مهمترين آن ها شامل: ژل ديفيرژن، ژل پرسیپتين، راديوايميونواسي، كوآگلوتيناسيون، روش اليزا ميباشد . در روش‌هاي ژل ديفيرژن و ژل پرسيپتين آنتروتوكسين غذا در مجاورت آنتي‌توكسين قرار داده مي‌شود و با واكنش رسوبي نتيجه آزمايش روشن ميگردد. تكنيك‌هاي مختلف اين روش‌ها قادرند مقادير كم آنتروتوكسين مانند 0.01 ميكروگرم را در ميلي‌ليتر نمونه بازيابي نمايد. آنتروتوكسين‌ها قبل از آزمايش بايستي از غذا استخراج و سپس تغليظ شوند. روش كوآگلوتيناسيون به صورت كيتا تجارتي موجود است و روش اليزا به علت حساسيت و ويژگي بالا و در عين حال سادگي آن در آينده بيشتر مقبول خواهد بود كه هم به فرم رقابتي و هم ساندويج قابل انجام است كه روش دوم بيشتر مقبول است.
روش اليزاي ميكروتايترپليت كه ساده بوده و از طريق مشاهده نتايج آن قابل خواندن است ، خلاصه روش آن به شرخ ذيل مي باشد:
استخراج آنتروتوكسين از غذا ( تهيه عصاره غذا )
شستشوي پليت اليزا و اضافه كردن عصاره‌هاي غذا ( آنتروتوكسين ) و شاهدها در حفرات پليت
گرمخانه گذاري 2 ساعت در درجه 37
خالي كردن حفرات و شستشوي آنها در 4 مرتبه متوالي
اضافه كردن آنتي‌سرم كنجوگه و گرمخانه گذاري يك ساعته در ◦25- 20
خالي كردن حفرات و شستشو در 5 مرتبه متوالي
اضافه كردن سوبسترا و گرمخانه گذاري در 25-20 درجه تا ايجاد واكنش قوي درشاهد مثبت (min 30- 45)
اضافه كردن ماده متوقف كننده و مخلوط كردن و خواندن واكنش از طريق مشاهده در برابر كارت مقايسه‌اي و يا پليت خوان در 414 نانومتر.
ويژگي‌هاي فيزيكي و شيميايي انتروتوكسينها
كليه اين سموم، prهاي سادهاي هستند كه در اثر هيدروليز آنها 8 اسيد آمينه توليد مي‌شود كه فراوانترين آنها آسپارتيك، گلوتاميك، ليزين و تيروزين ميباشد. اولين سمي كه توالي اسيدهاي آمينه آن تعيين شده پايانه N اين سم اسيدگلوتاميك و اسيد آمينه انتهايي پايانه C آن ليزين مي اشد. پايانه N ، SEC3 سدين ميباشد. پايانه N ، اسيدگلوناميك ميباشد .
SEC1 انتروتوكسينها در حالت فعال خود نسبت به آنزيم‌هاي پروتئوليتيك نظير تريپسين، كموتريپسين رنين و پاپائين مقاوم‌اند. ولي در PH حدود 2 به پپسين حساس ميباشد.
TSSTنسبت به پپسين حساس‌تر از انتروتوكسينها است. اگرچه برخي از ويژگي‌هاي فيزيكي و شيميايي انواع انتروتوكسينها با يكديگر متفاوت است ولي قدرت آنها تقريبا يكسان است.
انواع SEC بر اساس اتیوپ متمايز انتروتوكسينها كاملا به گرما مقاوم هستند. SEC در سرم باند متفاوت نسبت به SEA و SEB مقاومت بيشتري به گرما دارد. مقاومت حرارتي نسبي اين سه انتروتوكسين به صورت SEC>SEB>SEA ميباشد
نمونه خام توكسين و ناخالص نسبت به گرما مقاوم‌تر از توكسين‌هاي خالص شده است. مقاومت حرارتي ترمونوكلئاز استافيلوكوكي مشابه مقاومت حرارتي SEB ميباشد .
حساسيت SEB به دماي 80 درجه بيشتر از دماي 100 يا 110 ميباشد. در صورت گرمادهي در حضور پروتئين‌هاي گوشت تخريب حرارتي در دما‌ی 80 بيشتر از 60 يا 100 ميباشد.
حساسيت سلول‌هاي استافيلوكوكوس اورئوس در برابر حرارت در مقايسه با انتروتوكسينها بسيار بيشتر است. گرمادهي تا 1/71 درجه موجب نابودي چندين نژاد استافيلوكوكوس اورئوس مي‌شود و گرمادهي به روش مايكروويو به مدت MIN2 بيش از 2 ميليون سلول در هر گرم را نابود مي‌كند. حداكثر دماي رشد و مقاومت حرارتي نژاد MF31 اورئوس، هنگامي است كه در محيط كشت HIB حاوي سس سويا و منوسديم گلوتامات (MSG) رشد مي‌نمايد. حداكثر دماي رشد در حضور اين تركيبات بالاتر از 46 درجه و در غياب اين تركيبات در محيط كشت مايع 44 درجه ميباشد. مقاومت حرارتي با افزايش دماي رشد افزايش مي‌يابد، اما چنين تغييراتي در سلول‌هاي رويشي غير عادي ميباشد.
انتروتوكسين‌هاي استافيلوكوكي
انواع و ميزان انتشار آنها
SEC3 از لحاظ شيميايي و سرولوژيكي با SEC1 و SEC2 مرتبط ميباشد ولي شبيه آنها نيست. آنتي‌بادي‌هاي هر يك از انواع SEC با يكديگر واكنش متقابل مي‌دهند، هرچند از لحاظ آنتي‌ژني اندكي با يكديگر متفاوتند . 98% از توالي نوكلئوتيدي SEC3 مشابه SEC1 ميباشد. 68% از اسيدهاي آمينه SEB, SEC1 مشابه مي‌باشند . بين SEE, SEA واكنش متقابل رخ داده و برخي از آنتي‌بادي‌هاي SEB با انواع SEC واكنش متقابل مي‌دهند. برخي از علائم بيماري شوك سمي توسط C1, B, SEA ايجاد مي‌شوند. ژن‌هاي مسئول E, C1, B, SEA كروموزومي و ژن مسئول SED از نوع پلاسميدي مي‌باشند.
SEK, SEB روي محل ژن بيماري‌زايي اوروس قرار مي‌گيرند . SEA بيشتر از ساير انتروتوكسينها از مسموميت‌هاي غذایي بازيافت شده است و پس از آن SED در درجه دوم اهميت قرار مي‌گيرد. كمترين ميزان بروز مسموميت براي SEE گزارش شده است. انتشار نسبي انتروتوكسين‌هاي خاص در ميان نژادهاي بازيافت شده از منابع مختلف تفاوت زيادي با يكديگر دارند. بيش از 50% ارگانيسم‌هاي جدا شده، SEA را به تنهايي يا همراه با ساير انتروتوكسينها توليد مي‌كنند. در حالي كه تنها 8/7% ايزوله‌هاي انساني در سرپلاتيك SEA توليد مي2گردند.
نژادهاي توليد كننده SEB بيشتر از ساير نژادها ميباشد. در نژادهاي ايزوله شده از طيور وجود دارد تا در نژادهاي انساني از 80 نژاد جدا شده از مسموميت‌هاي غذائي 96% آنها SEA توليد مي‌كنند. در برزيل 50 مورد مسموميت غذائي استافيلوكوكي گزارش شده است كه پنيوميناس عامل آن است. عامل اين نوع شيوع يك نژاد TNase مثبت استافيلوكوكوس اورئوس بود كه SEC, SEB, SEA را در آن تشخيص دادند. و تعدادي افراد ازطريق شيرخام مبتلا شدند كه عامل شيوع گونه‌هاي استافيلوكوكي TNase غني غير از استافيلوكوكوس اورئوس بود. شير، حاوي توكسين‌هاي SED, SEC بوده و به تعداد بيش از 2×〖10〗^8 cfu⁄ml عامل شيوع مسموميت بود.
منشا ارگانيسم‌هاي عامل اين شيوع گاوهاي مبتلا به ورم پستان و افراد در تماس با مواد غذائي تشخيص داده شد. بيشتر نژادهاي انتروتوكسين‌زا متعلق به فاژ گروه III مي‌باشند اما تمام گروه‌هاي فاژي حاوي نژادهاي توكسين‌زا مي‌باشند.
توليد انتروتوكسينها
استافيلوكوكوس‌ها قادرند در شرايطي كه براي توليد انتروتوكسين مناسب نيستند، رشد كنند. در رابطه با فعاليت آبي، توليد انتروتوكسين ( به جز SEA) در مقايسه با رشد در دامنه‌ي نسبتا محدودتري رخ مي‌دهد. در بيكن پخت شده‌اي كه به صورت هوازي در دماي 37 درجه نگهداري شده نژاد A100 اورئوس در 84% aw به سرعت رشد كرده و SEA توليد مي‌كند. توليد هر يك از انتروتوكسينها بيشتر به ويژگي‌هاي ذاتي سم مربوط مي‌شود و به نژادهاي توليد كننده آنها ارتباط كمتري دارد.
SEA توسط سلول‌هاي فاز L توليد مي‌شود. براي حداكثر توليد انتروتوكسين‌هاي D, C, B يك ژن عملگر AGR مورد نياز است. در گوشت گوساله در فعاليت آبي 88 درصد انتروتوكسين توليد می‌شود ولي در 86% =aw انتروتوكسيني توليد نمي‌گردد. SEA در شرايطي از aw توليد مي‌شود كه SEB توليد نمي‌گردد. توليد SEB نسبت به فعاليت آبي حساس ميباشد. SEC هم به دما و هم به aw حساس است. در رابطه با PH, Nacl توليد انتروتوكسين در PH= 4 و در غايت Nacl گزارش شده است.
دماي بهينه توليد SEC, SEB در محيط كشت حاوي پروتئين هيدروليز شده 40 درجه و براي SEE در 6=PH نيز 40 درجه ميباشد. انتروتوكسين‌هاي استافيلوكوكي در محيط‌هاي كشت در عرض 6-4 ساعت ظاهر مي‌شود و به نسبت در طي فاز سكون و فاز انتقالي افزايش مي‌يابد. كلرامفنيكل از توليد انتروتوكسين ممانعت مي‌كند و اين نشان مي‌دهد كه حضور سم به سنتز محدود پروتئين بستگي دارد و SEC1 و SEC2 در صورت استفاده از كازئين كه به ميزان 3% توسط شيره لوزالمعده هضم شده است به عنوان سوبسترا نگهداري در دماي 37 درجه سانتيگراد در طي فاز لگاريتمي رشد و اوايل فاز سكون رشد مي‌كند . همچنين توليد SEA را افزايش مي‌دهد.
حداقل تعداد سلول‌هاي استافيلوكوكوس اورئوس لازم جهت توليد حداقل ميزان انتروتوكسين لازم جهت ايجاد علايم التهاب معده – روده‌اي در انسان (ing/g) با توجه به نوع سوبسترا و نوع انتروتوكسين متفاوت می‌باشد.
